DNA连接酶具有专一性。专一性是所有酶的特点，只要是酶就一定具有专一性。DNA连接酶属于酶，所以也具有专一性。具体体现在“只能连接脱氧核苷酸而不能连接核糖核苷酸”等方面。然而，DNA连接酶不具有特异性，因为它可以将两条DNA链连接到一起，无论是粘性末端还是平末端，只要两条链与同一条互补链配对结合，就可以被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。