DNA聚合酶作用位点是磷酸二酯键。DNA聚合酶的主要功能是在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。此外，DNA聚合酶还具有3’→5’外切酶活性（校对作用）和5’→3’外切酶活性（切除修复作用），分别用于识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，以及水解DNA延长链前方的DNA链，从而保证复制过程的保真性和准确性。