大巴车晚上十二点后可以上高速，但需要注意的是，在凌晨两点到五点之间，大巴车是禁止在高速公路上行驶的。根据《道路旅客运输企业安全管理规范》第三十八条规定，长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输；从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。此外，大巴车驾驶员需要遵守日间连续驾驶时间不得超过4小时，夜间连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间应不少于20分钟的规定。