平板划线法能够得到单菌落的原因主要是通过多次稀释菌种原液，使得在培养基表面形成由单个细胞繁殖而成的单菌落。
具体操作是，先将菌种试管里的菌在培养基上画几条短的平行线，然后用灭过菌的接种环在第一次画的一端再往边上画几条细线，如此重复以上操作多画几次，直到全部画满。这样越到后来菌种越稀少，最终就可以达到分离单个菌的目的。
需要注意的是，这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。