大客车不能在高速公路上行驶的时间是凌晨两点至五点。根据相关法律规定，夜间在道路上行驶的客运车辆凌晨2点至5点必须就近停靠在安全地带。此时驾驶员要及时提醒车上旅客不要随意走动。法律依据：《道路旅客运输企业安全管理规范》第三十八条

客运企业在制定运输计划时应当严格遵守客运驾驶员驾驶时间和休息时间等规定：

（一）日间连续驾驶时间不得超过4小时，夜间连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间应不少于20分钟；

（二）在24小时内累计驾驶时间不得超过8小时；

（三）任意连续7日内累计驾驶时间不得超过44小时，期间有效落地休息；

（四）禁止在夜间驾驶客运车辆通行达不到安全通行条件的三级及以下山区公路；

（五）长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输；从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。

一、大客车高速晚上几点禁行

1、大客车高速晚上两点到五点禁行。长途客运车辆在凌晨2点到5点禁止在高速上行驶，对于私家车或者小型轿车一天二十四小时都是可以在高速上行驶的，没有禁行时间。

2、法律依据：《中华人民共和国道路交通安全法》第六条

各级人民政府应当经常进行道路交通安全教育，提高公民的道路交通安全意识。

公安机关交通管理部门及其交通警察执行职务时，应当加强道路交通安全法律、法规的宣传，并模范遵守道路交通安全法律、法规。

机关、部队、企业事业单位、社会团体以及其他组织，应当对本单位的人员进行道路交通安全教育。

教育行政部门、学校应当将道路交通安全教育纳入法制教育的内容。

新闻、出版、广播、电视等有关单位，有进行道路交通安全教育的义务。

二、高速公路行驶要注意什么

1、在高速路上行驶的时候需要注意，在进入高速路口前，因为要从闸道进入，所以要注意左侧驶来的车辆，还要注意控制车速，在与前车保持足够安全距离以后，再进入高速再向前加速；

2、不要一直占用最左边的车道，因为在左边的车道容易有超车的车辆；

3、在高速公路上如果要超车，千万不能够从右边超车，应该从左侧超车；

4、如果在高速公路想要变道，一定要观察道路的情况，可以通过后视镜、侧视镜等等，观察后面前面的车辆，只有具备了变道条件以后才可以变道。

为了保证出行安全，客运车辆在凌晨2点到5点不准进入高速公路行驶，以此防止疲惫行驶。 因为高速限行现在只是针对大客车或者是卧铺方面的车辆。除非遇到特殊情况，比如说大雾天，大雨天，路面结冰，或者发生了比较大的交通意外高速路入口才会停业。 根据限定，凌晨2点至5点，客车禁止在高速公路途行驶。为此，交管部门在高速公路途设置了禁行标志牌。若有客车闯“禁”，将予以罚金100元记3分的处罚。根据法律规定，大客车在凌晨两点到五点不可以在国道行驶。由于高速公路本身的较低的安全系数。夜间能见度不高司机视认性差。夜间司机的驾驶疲劳，凌晨三四点是高速公路客车事故频发时段，大客车班次被安排在了五点之后，五点之前不允许行驶。禁止大客车行驶从根本上杜绝了此时间段的交通事故。大客车人多，安全第一。