目的基因接入质粒的方式理论上有两种：正向连接和反向连接。

正向连接即目的基因顺时针地按其上游到下游的方向与载体相连（与启动子的顺时针方向一致），这样，目的基因就能从上游到下游正常转录，表达产生所需的蛋白质，产生预期的性状；

目的基因也可以与质粒反向连接（反向连接），即目的基因的上下游方向颠倒地与载体相连，结果目的基因的转录从下游到上游，导致密码子全部改变，目的基因不能正常表达。为了防止出现反连现象，实验中常用双酶切的方法。